Har du problemer med å amplifisere GC-rike sekvenser?

Hvis du får en blank gel eller en 'DNA smear' når du prøver å amplifisere et GC-rikt templat, kan det være lurt å se nærmere på hvilke reagenser som er brukt (valg av polymerase, Mg²⁺ konsentrasjon og effekten av forskjellige tilsetningsstoffer), samt annealingstemperaturen til reaksjonen.

Mastermix-formater er ideelle og reduserer pipetteringsfeil, men gir lite fleksibilitet til oppsettet når det kommer til feilsøking av GC-rike PCR, men det finnes noen masterblandinger skreddersydd for å amplifisere GC-rike sekvenser (f.eks. OneTaq Hot Start 2X Master Mix med GC Buffer). Hvis du heller velger å bruke polymerasen frittstående som enkeltenzym, er det også lettere å justere reaksjonskomponentene når du optimaliserer.
 

Fire tips som kan hjelpe deg med optimaliseringen:
 

1. Valg av polymerase

Det er viktig å velge riktig polymerase for å amplifisere GC-rike regioner. Taq-polymerase er den vanligste polymerasen som brukes til PCR, men det finnes mange polymeraser som er spesifikt optimalisert for å amplifisere GC-rike sekvenser.

Innsikt
Polymeraser kan noen ganger stoppe opp ved de komplekse sekundære strukturene som ofte dannes når GC-rike strekninger folder seg sammen. Polymerasen blir dermed blokkert og det lages kortere/ufullstendige molekyler. GC-rike regioner kan også motstå denaturering, noe som gjør det vanskelig for primere å anneale, samt at primerne som brukes til å amplifisere GC-rike templater har en tendens til å danne dimerer. Å bytte til en annen polymerase kan noen ganger overvinne disse utfordringene.

Tips
Noen polymeraser leveres med en GC Enhancer som inneholder stoffer som bidrar til å hemme sekundær strukturdannelse og øke primerens evne til å binde til DNA.

OneTaq DNA-polymerase (NEB #M0480) har dobbelt 'fidelity' sammenliknet med Taq-polymerase og er ideell for både rutinemessig og GC-rik PCR. Den ble utviklet med både standard- og GC-buffere for å gi høyt utbytte og spesifisitet for spesielt vanskelige amplikoner. Opptil 80% GC-innhold kan amplifiseres ved å tilsette OneTaq High GC Enhancer til GC-bufferen.

For mer utfordrende sekvensområder har Q5^® High-Fidelity DNA-polymerase (NEB #M0491) mer enn 280 ganger så høy 'fidelity' som Taq, og ideell for lange eller vanskelige amplikoner inkludert GC-rikt DNA. Amplifikasjon kan forbedres på GC-rike sekvenser ved å tilsette Q5 High GC Enhancer til bufferen. Figuren nedenfor viser den robuste ytelsen til Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (NEB #M0492) på sekvenser med 25 til 70% GC-innhold. Til sammenligning gir den frittstående polymerasen fleksibilitet til å forsterke et bredere spekter av GC-innhold og kan gi robust ytelse hos sekvenser med opptil 80% GC, takket være GC Enhanceren som følger med polymerasen.

Fig. 1: Forskjellige Q5 format tillater robust amplifisering av et bredt spekter av sekvenser.
 

En liten digresjon for deg som jobber med blodprøver: NEB har nettopp lansert Q5 Blood Direct 2X Master Mix (NEB #M0500) som fungerer bra for amplikoner på opptil 75% GC-innhold, og som har en buffer som gir økt motstand mot inhibitorer i blodet. Du kan også hoppe over det vanlig DNA-rensetrinnet og amplifisere målsekvensene direkte fra tørkede blodflekker eller opptil 30% fullblod, noe som vil effektivisere arbeidsflyten din. 
 

2. Mg²⁺ konsentrasjon

Magnesium er en kofaktor i PCR. Det har noen viktige roller i reaksjonen blant annet ved å være nødvendig for den enzymatiske aktiviteten til polymerasen og muliggjør tilsetning av dNTP-er, i tillegg til å være avgjørende for primerbinding. For mye MgCl₂ kan føre til uspesifikk primerbinding under annealingstrinnet, noe som vil observeres som flere DNA-bånd på en agarosegel. På den andre side vil for lite MgCl₂ forårsake redusert polymeraseaktivitet som fører til svak eller ingen amplifikasjon.

Innsikt
Mg²⁺ har flere viktige roller i PCR-reaksjonen og MgCl₂ tilsettes derfor vanligvis i bufferen som følger med polymerasen. For standard PCR-reaksjoner er 1,5 til 2 mM MgCl₂ den mest brukte konsentrasjonen, men DNA-templater med høyt GC-innhold kan kreve andre konsentrasjoner.

Tips
Hvis du mistenker at Mg²⁺ konsentrasjonen er årsaken til en mislykket PCR, anbefaler vi deg å prøve en konsentrasjonsgradient av MgCl₂ for å finne den gunstigste konsentrasjonen hvor du eliminerer uspesifikk binding samtidig som du maksimerer utbyttet. Prøv 0,5 mM intervaller mellom 1,0 og 4 mM.
 

3. Effekter av tilsetningsstoffer

Mange kjente tilsetningsstoffer påvirker amplifiseringen av GC-rike regioner. De fungerer ved å enten:

• redusere sekundære strukturer, noe som øker amplifiseringen av målsekvensen din, eller
• redusere ikke-spesifikk priming og amplifikasjon av off-target DNA

Innsikt

• DMSO, glyserol og betain reduserer sekundære strukturer som kan hemme polymerasen
• Formamid og tetrametylammoniumklorid øker primerens evne til å binde DNA, som igjen øker spesifisiteten
• 7-deaza-2′-deoksyguanosin er en dGTP-analog som kan forbedre PCR-utbyttet til GC-rike regioner, men den kan gi dårlig farging på gel da det kan være utfordrende å interkalere noen fargemidler

Tips
Hvis du ikke vet hva som forårsaker den dårlige amplifiseringen kan det være vanskelig å vite hvilket tilsetningsstoff som vil fungere best. Det er arbeidskrevende å teste alle ved å bruke ulike konsentrasjonsgradienter for hver og en. Videre vil individuell testing av hvert tilsetningsstoff tilføre mange nye variabler til optimaliseringen av arbeidsflyten din.

New England Biolabs har utviklet to polymeraser med optimaliserte GC Enhancere (diskutert ovenfor i polymerasedelen) som inneholder forskjellige GC-rike PCR-forsterkende tilsetningsstoffer: OneTaq DNA Polymerase (NEB #M0480), og Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (NEB #M0491).
 

4. Annealingstemperatur

Flere bånd på en gel er en indikasjon på ikke-spesifikk binding, og da kan en løsning være å øke annealingstemperaturen (Ta). Hvis du ikke får noe produkt i det hele tatt, er annealingstemperaturen kanskje for høy.

Innsikt
Tm er primerens smeltetemperatur, og Ta er primerens annealingstemperatur. Det er vanlig å designe primere med en Tm på mellom 50 og 72°C, og primer-annealingstemperaturen (Ta) bør være omtrent 5°C lavere enn Tm.

I en PCR-reaksjon er det vanligvis primer i overskudd og begrenset med templat. Tm er temperaturen der det er likevekt mellom fri og bundet primer og templat. 

Som nevnt ovenfor har et G-C-par tre hydrogenbindinger, og et A-T-par to hydrogenbindinger. Basert på dette kan du forutsi at jo høyere GC-innhold, desto høyere temperatur kreves for å bryte dem. Generelt resulterer en høyere Ta i mer spesifikk primerbinding, men mindre produktdannelse (så flere PCR-sykluser kan være nødvendig). Men hvis annealingstemperaturen blir for høy, vil primeren få redusert templathybridisering.

Tips
For å forhindre uspesifikk amplifisering kan du prøve en høyere annealingstemperatur (Ta). Dette kan også bidra til å splitte sekundære strukturer. Prøv ut en temperaturgradient eller bruk en høyere annealingstemperatur for de første par PCR-syklusene.

NEB sin Tm Calculator kan hjelpe deg med å vurdere hva som er den beste Ta for PCR-reaksjonen din; den tar hensyn til enzymet og bufferen du har tenkt å bruke.

Det er viktig å huske på at det ikke finnes en universell løsning som fungerer bra for alle GC-rike amplikoner. Virkningen av å endre en parameter som skissert ovenfor vil være målspesifikk, så det som fungerer for ett amplikon fungerer kanskje ikke for et annet (f.eks. kan det hende du trenger 10% OneTaq GC Enhancer for en sekvens, men 20% for en annen). Egen optimalisering vil derfor være nødvendig for hvert tilfelle. 
 

Lykke til!
Og kontakt oss gjerne dersom du ønsker hjelp til optimaliseringen. 
 

Tilpasset fra Gibson J. “Four tips for PCR amplification of GC-rich sequences”, nebinspired-blog.
https://international.neb.com/nebinspired-blog/four-tips-for-pcr-amplification-of-gc-rich-sequences
 

Bloggforfatter

Mari Gilde
Produktspesialist